لب‌مگ | مجله تخصصی آزمایشگاه

 

مقدمه

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) یکی از روش‌های تحلیلی کلیدی در شیمی تجزیه مدرن است که با دقت بالا می‌تواند اجزای سازنده یک نمونه پیچیده را جداسازی، شناسایی و اندازه‌گیری کند. این تکنیک به دلیل کارایی بالا و قابلیت تکرار‌پذیری، از آزمایشگاه‌های تحقیقاتی گرفته تا کنترل کیفی صنعتی، کاربرد فراوان دارد.

 

اساس عملکرد HPLC

HPLC بر پایه حرکت فاز متحرک (حلال) با فشار بالا در میان فاز ساکن (ستون کروماتوگرافی) عمل می‌کند. مواد موجود در نمونه با سرعت‌های متفاوتی از ستون عبور کرده و براساس برهم‌کنش‌هایی همچون قطبیت، اندازه مولکولی یا بار، جداسازی می‌شوند.

 

اجزای دستگاه HPLC

پمپ (Pump): وظیفه تأمین جریان پایدار و دقیق حلال را دارد. پمپ‌های مدرن قادر به ایجاد فشارهایی تا بیش از 400 بار هستند.

دگازور (Degasser): برای حذف گازهای حل‌شده از حلال‌ها به‌کار می‌رود و مانع ایجاد حباب در مسیر جریان می‌شود.

سیستم تزریق (Injector): معمولا از لوپ تزریق یا اتوسمپلر برای وارد کردن مقدار دقیقی از نمونه استفاده می‌شود.

ستون (Column): هسته اصلی جداسازی است که معمولا از جنس فولاد ضدزنگ بوده و با مواد فاز ساکن نظیر C18 پر شده است.

آشکارساز (Detector): رایج‌ترین نوع آن، آشکارساز فرابنفش (UV-Vis) است. آشکارسازهای دیگر مانند فلورسانس، DAD و MS نیز استفاده می‌شوند.

سیستم جمع‌آوری و پردازش داده: نتایج را ثبت و تحلیل می‌کند و کروماتوگرام خروجی را تولید می‌کند.

 

انواع روش‌های HPLC

HPLC فاز معکوس (RP-HPLC): متداول‌ترین نوع؛ فاز ساکن غیرقطبی و فاز متحرک قطبی است.

HPLC فاز نرمال: فاز ساکن قطبی (مثل سیلیکا) و فاز متحرک غیرقطبی (مثل هگزان).

Ion Exchange HPLC: جداسازی بر پایه بار الکتریکی ترکیبات.

Size Exclusion HPLC: جداسازی بر اساس اندازه مولکولی.

Affinity HPLC: بر پایه برهم‌کنش‌های زیستی خاص مثل آنتی‌ژن-آنتی‌بادی.

 

انتخاب ستون مناسب

انتخاب ستون مناسب نقش تعیین‌کننده‌ای در کیفیت جداسازی دارد. فاکتورهایی مانند:

طول ستون

قطر داخلی

اندازه ذرات (معمولاً 3یا 5 میکرون)

نوع فاز ساکن (C18، C8، فنل، CN و غیره)

باید بر اساس ماهیت نمونه و هدف آنالیز انتخاب شوند.

 

انتخاب فاز متحرک

فاز متحرک باید متناسب با نوع ستون و ترکیبات مورد آنالیز انتخاب شود. حلال‌هایی مانند آب، متانول، استونیتریل و بافرهای فسفاتی رایج هستند. در HPLC فاز معکوس، ترکیب آب و استونیتریل بسیار متداول است.

 

شرایط عملیاتی و بهینه‌سازی

برای بهینه‌سازی شرایط HPLC باید موارد زیر مدنظر قرار گیرد:

pH مناسب برای پایداری ترکیبات و ستون

نرخ جریان (Flow Rate) بهینه

دمای ستون برای افزایش تکرارپذیری

گرادیان مناسب در صورت استفاده از حلال‌های دوگانه

 

تفسیر کروماتوگرام

کروماتوگرام خروجی شامل پیک‌هایی است که موقعیت (زمان بازداری) و مساحت آن‌ها نشان‌دهنده نوع و مقدار ترکیبات موجود است. پارامترهایی مانند:

 

Resolution (رزولوشن): توانایی جداسازی دو پیک مجاور

Tailing Factor: نشان‌دهنده تقارن پیک

Efficiency (N): بازده ستون

 

برای ارزیابی کیفیت آنالیز به‌کار می‌روند.

 

مشکلات رایج و رفع آن‌ها

مشکل	علت احتمالی	راه‌حل
پیک دارای دُم (tailing)	آلودگی ستون، ناسازگاری pH	شست‌وشوی ستون، تنظیم pH
افت فشار	انسداد در فیلتر یا ستون	تعویض فیلتر یا شست‌وشوی ستون
پیک‌های پهن یا ادغام شده	ستون فرسوده یا نرخ جریان نامناسب	تعویض ستون یا تنظیم دبی
تکرارپذیری پایین	خطای تزریق یا اشکال در پمپ	سرویس تزریق‌کننده، کالیبراسیون پمپ

 

مقایسه HPLC با GC (کروماتوگرافی گازی)

ویژگی	HPLC	GC
نوع فاز متحرک	مایع	گاز
ترکیبات قابل آنالیز	قطبی، گرماحساس	فرار، غیرقطبی
دمای کاری	دمای اتاق تا 60–80°C	دمای بالا (تا 300°C)
آشکارسازها	UV, DAD, MS	FID, TCD, MS
دقت و حساسیت	بالا	بسیار بالا در ترکیبات فرار

 

کاربردهای تخصصی‌تر

فارماکوکینتیک: بررسی نحوه جذب، توزیع و دفع داروها در بدن

تحلیل سموم در محیط‌زیست

آنالیز ناخالصی‌ها در مواد شیمیایی

کنترل کیفی در تولید محصولات آرایشی و بهداشتی

 

جمع‌بندی

HPLC یکی از قدرتمندترین و دقیق‌ترین ابزارهای آنالیز شیمیایی است که با پیشرفت فناوری، قابلیت‌های آن روز به روز در حال توسعه است. درک عمیق از اصول عملکرد، انتخاب شرایط مناسب و نگهداری صحیح از دستگاه، نقش بسزایی در موفقیت آنالیزها دارد.

پیشنهاد برای مطالعه بیشتر

برای مطالعه مقاله مرتبط در این زمینه، می‌توانید به لینک زیر از سایت نانوابزار مراجعه کنید:

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)